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Ricardo Fernández-Valadés Gámez
Densidad Ósea tras injerto óseo generado por Ingeniería Tisular
INTRODUCCIÓN
La fisura palatina es una malformación congénita frecuente
del área craneofacial, siendo su incidencia alrededor de 1 cada 700
nacidos vivos (1). Hasta el momento se han desarrollado multitud
de técnicas quirúrgicas para su corrección; en un primer tiempo
quirúrgico se realizan colgajos mucoperósticos para aislar la cavidad
oral de la cavidad nasal y recolocar la musculatura palatina con el
fin de mejorar la fonación y deglución. Posteriormente es necesaria
la aportación de tejido óseo a nivel de la fisura alveolar, si esta está
presente (alveoloplastia) (2). El uso de injertos óseos mejora los
resultados quirúrgicos y permite alcanzar una estética y una función
adecuada (3-5). Los injertos óseos cierran la comunicación oronasal,
dan soporte al cartílago alar, estabilizan una morfología alveolar
adecuada, dan continuidad al arco maxilar y permiten dar soporte
a dientes adyacentes facilitando la manipulación ortodóncica, la
erupción dental o una rehabilitación protésica posterior cuando estas
sean necesarias (2, 6, 7).
Para la obtención de hueso para llevar a cabo la alveoloplastia,
se han descrito múltiples zonas donantes de hueso autólogo,
siendo el injerto de cresta iliaca el más popular (3-5). La incidencia
de complicaciones con esta técnica es baja, aunque no está exenta
de efectos adversos como dolor, hematomas o seromas en la
región donante, y conlleva un aumento de la estancia hospitalaria
(8-12). Esto nos lleva a la búsqueda de técnicas alternativas, menos
invasivas, con el fin de evitar la morbilidad en la zona donante. Se ha
descrito el uso de diferentes opciones como materiales aloplásticos,
xenoinjertos, etc. Estos materiales presentan una serie de riesgos y
complicaciones (transmisión de infecciones, respuesta inmunológica,
fístulas oronasales…) y además, no son recomendables en pacientes
en periodo de crecimiento, cuando van a erupcionar piezas dentales,
o si van a ser necesarios movimientos ortodóncicos (3, 10, 13-16).
En los últimos años ha habido un gran avance en el campo
de la ingeniería tisular, lo que ha permitido la creación de múltiples
tejidos (cornea, piel, mucosa oral, urotelio, tejido óseo, etc.) a partir
de pequeñas biopsias de los tejidos que se quieren reproducir o de
célulasmadre de origenmesenquimal (13, 17-19). Estudios realizados
enanimales deexperimentación, sugierenqueel tejidoóseoobtenido
mediante ingeniería tisular puede ser una alternativa válida para el
tratamiento de pacientes con defectos palatinos (20-23).
En este trabajo se ha realizado un estudio de experimentación
básica en animales de laboratorio, para valorar la densidad ósea
tras la utilización de injertos óseos autólogos artificiales generados
mediante ingeniería tisular y determinar la utilidad in vivo de estos
materiales aplicando un nuevo método basado en tomografía
computerizada y unidades Hounsfield.
MATERIAL Y MÉTODOS
Animales de experimentación.
Enesteestudiohemos utilizado12 conejosmachos
(NewZeland
White)
de 3 semanas de edad y entre 400 y 500 gramos (momento
del destete). Todos los animales fueron mantenidos en la Unidad
Experimental del ComplejoHospitalarioUniversitariodeGranada, con
libre acceso a comida y agua. El estudio fue aprobado por el comité de
ética local, y se ajustó al reglamento sobre experimentación animal,
siguiendo la regla de las tres R (24).
Generación de tejido óseo.
Para la generación de un sustituto de hueso palatino, en primer
lugar, se obtuvieron cultivos de células madre mesenquimales del
tejido adiposo de cada animal de experimentación.
Para ello a las 3-4 semanas de vida del conejo (destete) se
tomaron dos biopsias de 1x1cm del tejido adiposo a nivel de ambos
pliegues inguinales bajo anestesia general y local, suturando con
materialreabsorbible
(Safil
®
4/0).
Laanestesiageneralfueadministrada
utilizando inyección intramuscular de Ketamina y Xilazina, y para la
local infiltración con Bupivacaina 0,25% sin vasoconstrictor (Figura 1).
Tras la toma, lasmuestras fueron introducidas enmediode transporte
estéril compuesto por medio de cultivo RPMI suplementado con
antibióticos (500U/ml de penicilina y 500μg/ml de estreptomicina) y
antimicóticos(1,25μg/mldeanfotericinaB)paraevitarcontaminación
de la muestra, y mantenidas a 4ºC hasta su procesamiento.
Estas muestras obtenidas se lavaron con PBS y se digirieron
enzimáticamente en una solución de 2mg/ml de colagenasa I de
Clostridium hystoliticum
, para la obtención de cultivos celulares de
células madres mesenquimales de origen adiposo. Estos cultivos se
mantuvieron en medio de Dullbecco (DMEM) suplementado con
suero bovino fetal al 10% (FCS), según la técnica descrita por Nieto-
Aguilar et al, 2011 (17).
Una vez subconfluentes, se tripsinizaron los cultivos celulares
y se combinaron con biomateriales de fibrina y agarosa 0’1%
(aproximadamente 175000 células/ml), previamente descritos por
el grupo de investigación de ingeniería tisular (20), utilizándose
ácido tranexámico, como agente inhibidor de la fibrinolisis, y cloruro
cálcico como inductor de la gelificación del biomaterial. Tras ello se
alicuotó la mezcla en placas de cultivo de 6 pocillos que se incubaron
a 37ºC durante 24 horas hasta su total solidificación. Para inducir la
diferenciación de estas células hacia la estirpe osteogénica y generar
un tejido óseo artificial, los constructos se cultivaron en un medio
inductor específico compuesto de DMEM suplementado con 10%
de FCS, 100nM de dexametasona, 10nM β-glicerol-fosfato y 50mML
de ácido ascórbico durante 21 días, como describió Nieto-Aguilar
(17). Una vez transcurrido el periodo de diferenciación se extrajeron
los tejidos artificiales de las superficies de cultivo y se sometieron a
compresión plástica (nanoestructuración) utilizando un biorreactor
específico según lo descrito (20). Posteriormente se implantaron en
los animales de experimentación de forma autóloga.
Implante in vivo y grupos de estudio.
De forma aleatoria, a las 7-8 semanas de vida, dividimos los
conejos en 3 grupos:
• Grupo I
.
En un primer grupo, bajo anestesia general,
elevamos colgajo mucoperióstico y creamos defectos
óseosde4mmaniveldelsegundomolarenelladoderecho
mediante fresa de trefina. Posteriormente implantamos
el tejido óseo autólogo obtenido por ingeniería tisular, y
cubrimos con el colgajo mucoperióstico y cerramos con
puntos sueltos de sutura reabsorbible (Safil
®
5/0). (Figura
2)
• Grupo II
.
Como controles negativos, en un segundo grupo
de conejos, realizamos el mismo procedimiento, pero sin
material implantado tras la creación del defecto óseo.
Figura1. Tomadebiopsiadegrasaanivel del pliegue inguinal del conejo.